RÉSUMÉ Différentes techniques d'évaluation de l'activité des antibiotiques peuvent être mises en couvre au laboratoire de bactériologie : elles reposent sur les mesures de CMI (concentration minimale inhibitrice) et CMB (concentration minimale bactéricide). La mise en route d'une antibiothérapie avant que l'infection soit documentée tient compte du spectre des antibiotiques. Si l'infection est documentée, l'antibiogramme donne une réponse qualitative (sensible, intermédiaire, résistant) à un panel d'antibiotiques.
Dans certaines situations, une réponse quantitative de l'activité bactériostatique (détermination de la CMI) et de l'activité bactéricide des antibiotiques seuls et associés est nécessaire à une antibiothérapie plus adaptée à la bactérie responsable d'infection.
Deux mesures sont à la base de toutes les techniques d'étude de l'activité des antibiotiques:
CMI : concentration minimale inhibitrice: plus petite concentration d'antibiotique qui inhibe toute culture visible d'une souche bactérienne après 18 heures de culture à 37°C. Cette valeur caractérise l'effet bactériostatique d'un antibiotique.
CMB : plus petite concentration d'antibiotique laissant 0,01% ou moins de survivants de l'inoculum initial après 18 heures de culture à 37°C. Cette valeur caractérise l'effet bactéricide d'un antibiotique. Différentes techniques dérivent de ces deux mesures; le laboratoire de bactériologie effectuera ces techniques en fonction des différentes étapes de l'analyse bactériologique.
1. Mise en route d'une antibiothérapie Appréciation de l'activité bactériostatique des antibiotiques Iizfection documentée
Devant toute bactérie présumée pathogène, le laboratoire détermine son profil de sensibilité à différents antibiotiques. Les réponses sont sous forme qualitative: sensible, intermédiaire, résistant. Elles résultent d'une détermination semi-quantitative du pouvoir bactériostatique des antibiotiques.
Différentes techniques sont possibles : en milieu gélosé par diffusion avec des disques chargés en antibiotique ou en milieu liquide avec différentes concentrations d'antibiotiques dans les méthodes automatisées.
La méthode de diffusion en gélose consiste à déposer des disques de papier imprégnés d'antibiotiques sur une gélose ensemencée avec la bactérie à étudier. Il s'établit dans la gélose un gradient de concentration d'antibiotique autour de chaque disque. Après 18 heures d'incubation, il se produit un halo d'inhibition autour de chaque disque qui permet de mesurer un diamètre. Ce diamètre reflète la valeur de la CMI. La comparaison de ce diamètre aux diamètres critiques publiés par le CASFIVI (Comité de l'antibiogramme de la Société Française de Microbiologie) permet de répondre qualitativement si la souche étudiée est sensible. intermédiaire ou résistante. Ces diamètres critiques résultent de l'intégration de plusieurs données : concentrations sériques et tissulaires des antibiotiques obtenues ire vivo avec des posologies habituelles, concentrations inhibitrices observées sur un grand nombre de souches sensibles et résistantes appartenant à différentes espèces. confrontation avec des résultats cliniques. L'hétérogénéité des populations bactériennes vis à vis de la sensibilité aux antibiotiques est de plus en plus prise en compte : des analyses mathématiques plus fines permettent d'intégrer à laide de l'outil informatique des données plus complexes telles que la variabilité statistique des méthodes utilisées.
En fait, la lecture d'un antibiogramme standard ne se limite pas à la mesure de diamètres. mais doit tenir compte de la reconnaissance des mécanismes probables de résistance : ceci correspond à la lecture interprétative de l'antibiogratmne. L'interprétation ne se limite pas à la lecture d'un seul antibiotique. mais elle est basée sur la lecture comparée de plusieurs molécules d'une même famille d'antibiotiques, voire d'autres familles pour mieuy déceler les mécanismes de résistance faiblement exprimés.
Les méthodes en milieu liquide se prêtent à l'automatisation : différents svstèmes existent sur le marché.
Cependant toutes les bactéries ne peuvent être étudiées en milieu liquide. et il est parfois indispensable de revenir à la méthode en milieu gélosé pour l'étude de certains mécanismes de résistance.
La lecture dans les deux cas peut être couplée à un système expert qui contribue à la fiabilité du résultat rendu.
Dans certaines situations. la réponse qualitative ne suffit pas: la détermination précise de la CNII est demandée pour mieux préciser le niveau d«activité des molécules. Couplée au dosage des antibiotiques dans le sérum des patients, la détermination peut permettre d'adapter les posologies, le mode d'administration : ceci est particulièrement vrai chez le brûlé.
Plusieurs méthodes permettent de réaliser cette détermination: en milieu liquide ou en milieu gélosé. La technique du E Test est une méthode simple d'utilisation. en milieu gélosé qui se prête à des déterminations unitaires: elle utilise des bandelettes (commercialisées sous le nom E Test) avec un gradient exponentiel continu d'antibiotique sur une face et une échelle de lecture de concentration sur l'autre face.
2. Aise en route de l'antibiothérapie avant la connaissance des résultats de l'antibiogramme Infection non documentée
L'antibiothérapie est dite probabiliste, elle se base sur:
Ce spectre tient compte de la résistance naturelle et acquise des espèces et de la détermination des CN11 50 et CMI 90 : concentration minimale qui inhibe `,0° o ou 90° o des souches d'une espèce bactérienne donnée.
Des règles de consensus sont établies pour certains groupes d'infections.
3. Appréciation de l'activité bactéricide des antibiotiques
Quand ?
Dans certaines situations cliniques, la détermination de l'activité bactéricide peut être utile : c'est le cas principalement des endocardites, des infections graves. des infections survenant chez un immunodéprimé .....
Comment ?
Plusieurs techniques permettent de juger de l'activité bactéricide des antibiotiques.
Elle peut se mesurer à temps fixe, généralement au bout de 18 heures de contact entre la bactérie et l'antibiotique. La CNIB étant la plus petite concentration d'antibiotique ne laissant pas plus de 0.0 1°o de survivants. les techniques sont basées sur des numérations bactériennes qui comparent le nombre de bactéries entre l'inoculum de départ et après l'action des antibiotiques. Ces techniques sont le plus souvent réalisées en milieu liquide.
Il découle de cette mesure une classification des antibiotiques en 2 groupes: les antibiotiques bactéricides, les CMB sont proches des CMI, et les antibiotiques bactériostatiques, les CMB sont éloignées des CMI.
Pour les antibiotiques dits bactéricides (Béta-lactamines, aminosides, fluoroquinolones), certaines souches peuvent présenter un état de tolérance : dans ce cas, les CMB sont au moins 32 fois supérieures aux CMI.
L'activité bactéricide des antibiotiques peut se mesurer à temps variable et consiste à déterminer le nombre de survivants au cours du temps; les résultats sont exprimés sous forme de courbe reliant le logarithme du nombre de survivants au temps. Pour certains antibiotiques, l'activité bactéricide augmente avec la concentration d'antibiotique: ces antibiotiques sont dits concentration dépendante, et ont généralement une vitesse de bactéricidie rapide (les aminosides représentent cette catégorie d'antibiotiques). Pour d'autres l'intensité de la bactéricidie augmente avec la concentration d'antibiotique jusqu'à un certain niveau, et est corrélée avec la durée pendant laquelle la concentration dépasse la CMI: ces antibiotiques, dits temps dépendants sont les Béta-lactamines, les glycopeptides. Cette observation est à la base du mode d'administration proposé en une dose journalière pour les antibiotiques concentration dépendants et en doses fractionnées, voire en continu pour les antibiotiques temps dépendants
Un des principaux objectifs de réaliser une association est de rechercher une action synergique. Cette synergie est appréciée en bactéricidie en mesurant l'activité bactéricide de deux antibiotiques à temps fixe, en 24 heures ou à temps variable, en cinétique.
A temps fixe, la technique de l'échiquier est la plus complète, mais la plus fastidieuse à mettre eu oeuvre. Elle ne se réalise pas en pratique courante. Elle consiste à étudier différentes concentrations de deux antibiotiques seuls et associés. Les résultats sont exprimés d'une part pour la bactériostase par le FIC index et d'autre part pour la bactéricidie par le FBC index (1).
Le même calcul est effectué pour déterminer le FBC. Une association est synergique si ces index sont <0,5, antagoniste s'ils sont > 2.
La technique réalisable en pratique courante correspond à la technique du Triangle. Une seule concentration d'antibiotiques est choisie pour chaque antibiotique; elle est déterminée par la concentration sérique moyenne obtenue avec des posologies habituelles. Cette technique permet l'étude de plusieurs antibiotiques et de leurs associations deux par deux selon un schéma triangulaire. Les résultats sont exprimés en pourcentage de survivants pour chaque antibiotique seul et pour les différentes associations: les associations bactéricides correspondent à celles ne laissant pas plus de 0,01 % de survivants. Cette technique peut permettre de choisir parmi différentes associations celle ou celles qui sont bactéricides.
A temps variable, les interactions entre antibiotiques peuvent être étudiées en cinétique. Des courbes de bactéricidie sont tracées en exposant les bactéries à 2 antibiotiques seuls et associés; là encore les concentrations sont fixes et choisies en fonction des concentrations obtenues in vivo, avec des posologies habituelles. Une association sera synergique si une diminution de 2 log 10 est obtenue avec l'association par rapport à l'antibiotique le plus efficace pris isolément.
4. Contrôle du traitement antibiotique
Ce test, appelé test de Heilman correspond à l'étude du pouvoir bactériostatique et bactéricide du sérum, prélevé au moment du pic sérique du ou des antibiotiques administrés : il consiste à diluer le sérum en progression géométrique de raison 2 et à déterminer la plus grande dilution bactériostatique et la plus grande dilution bactéricide ne laissant pas plus de 0,01 % de survivants. Le moment du prélèvement par rapport au moment de l'administration du ou des antibiotiques est capital: 15 minutes après si la voie est intraveineuse, 1 heure si la voie est intramusculaire, 2 heures si la voie est orale. Une dilution d'au moins 1/8 en bactéricidie est considérée comme satisfaisante : mais les résultats seront confrontés aux résultats cliniques.
Le dosage sérique d'un antibiotique est essentiellement demandé pour adapter les posologies pour les antibiotiques qui présentent un risque de toxicité, notamment les glycopeptides et les aminosides.
Il peut permettre également d'évaluer des contrôles d'efficacité, si les concentrations obtenues ne sont pas supérieures à la CMI.
Les mêmes règles, qui s'appliquent au test de Hellman, sont dictées pour le moment du prélèvement par rapport au mode d'administration de l'antibiotique.
De très nombreuses techniques sont réalisables pour évaluer in vitro l'activité des antibiotiques : elles sont toutes basées sur la détermination des concentrations minimales bactériostatiques et bactéricides. Ces techniques sont de plus en plus standardisées par des comités de réflexion dans chaque pays : une harmonisation entre ces différents pays est en cours, notamment au niveau de l'Europe.
La mise en oeuvre de techniques complexes et l'interprétation des résultats nécessitent une confrontation bactério-clinique.
Différent technicis of assessments of thé antibiotic activity can bc performed by thé Laboratory of Bacteriology : rates of CMI (Inhibitory Minimal Concentration) and CMB (Bactericidal Minimal Concentration). The starting up of an antibiotherapy before documentation of thé infection is related to thé antibiotic spectrum. If thé infection is documented, thé antibiogram gives a qualitative answer (appreciable, intermediate, résistant) to a panel of antibiotics.
In some cases, a quantitative answer of bacteriostatic activity (détermination of thé CMI) and bactericidal antibiotic activity alonc and associated partners are necessary to an antibiotherapy more adapted.
Keys words: Infection - bacteriology - antibiotherapy.